Viac ako 20 rokov čelila morská biológka Mary Hagedorn zdanlivo nevyriešiteľným problémom. Hľadala spôsob, ako zmraziť a rozmraziť embryá zebry.
Gény zebrafish, ktoré sú dôležitým experimentálnym zvieraťom, sa priblížia tým, ktoré sú u ľudí dostatočne blízko na to, aby sa použili na vyšetrovanie chorôb, ako je svalová dystrofia a melanóm. Ak by sa množiteľský materiál mohol ľahko zmraziť a rozmraziť, tieto štúdie by sa dali ľahšie vykonať a replikovať, pretože vedci by nemuseli pracovať na rozvrstvovaní alebo bojovať proti genetickému únosu.
Problémy sa týkajú spôsobu reprodukcie rýb. Vedci úspešne mrazili - alebo kryokonzervovali, aby používali technický termín - a rozmrazovali životaschopné spermie a vajíčka mnohých zvierat už desaťročia. Rybie vajcia sa však vyvíjajú mimo tela rodiča, čo predstavuje fyziologické problémy, ktoré neprichádzajú pri práci s bunkami hovädzieho dobytka alebo s ľuďmi. Vajec obsahuje živiny, ktoré bude vyvíjajúce sa embryo potrebovať, a tiež má svoje vlastné brnenie, čo znamená, že tieto vajcia sú veľké a často obalené v relatívne nepriepustnej membráne.
Zjednodušene povedané, rybie vajcia bývajú za bežných okolností príliš veľké na to, aby rýchlo zmrazili alebo rozmrazili. Hagedorn - ktorý pracuje ako vedecký biológ v Centre pre prežitie druhov v Smithsonianskom národnom zoologickom a ochranárskom biologickom ústave - ich porovnáva s planétami. Cicavčie vajcia sú zvyčajne skôr úhľadnejšie ako členovia našej slnečnej sústavy - povedzme: Merkúr. Vajcia zebrafish je bližšie k obrie ako Jupiter.
"Ak nezmrazíte tkanivo správne, v ňom sa vytvoria ľadové kryštály, ktoré prepichnú bunky a zničia ich, " hovorí Hagedorn.
Strávila 12 rokov hľadaním riešenia a nakoniec sa rozhodla pre nové riešenie, ktoré zahŕňalo mikroinjekciu „kryoprotektantu“ (v podstate nemrznúcej zmesi) do vajíčok, techniky, ktorá umožnila tomuto agentovi obísť ochrannú membránu. Ak sú tieto ochranné látky správne kalibrované, aby sa zabránilo otrave buniek, mohli by pomôcť zaistiť, aby vajce rovnomerne vitrifikovali (boli podobné sklu), keď sa namočili do kúpeľa s tekutým dusíkom.
"Ak nechcete zmraziť tkanivo správne, v ňom sa vytvoria ľadové kryštály, ktoré prepichnú bunky a zničia ich, " hovorí Mary Hagedornová o probléme, ktorému čelila pri pokusoch o zmrazenie embryí zebrafish. (Encyklopédia života / Bioimages) Aj keď tento proces mohol účinne uviesť embryá rýb do stavu pozastavenej animácie, zohrievanie ich späť späť ostáva problémom. Keď sa zahrievajú, existuje medziľahlý bod medzi ideálnym stavom v tvare skla a teplotou miestnosti, kde sa môžu znova začať tvoriť ľadové kryštály. A tieto kryštály môžu poškodiť bunkový materiál a spôsobiť jeho ďalší vývoj.
"Potrebovali sme ich rozmraziť oveľa rýchlejšie, " povedal Hagedorn. „Pomocou nástrojov, ktoré sme mali v roku 2011., , Narazil som na stenu. “
Na chvíľu sa vzdala.
A tak by to mohlo zostať, keby nebolo náhodného stretnutia na kryokonzervačnej konferencii niekedy v roku 2013, kde si vypočula prezentáciu profesora strojárstva Johna Bischofa na Minnesotskej univerzite.
Ako hovorí Bischof, predstavoval nesúvisiacu tému týkajúcu sa nanočastíc oxidu železitého, ktorú jeho laboratórium použilo pri bezpečnom prehriatí ľudského tkaniva na transplantáciu. Jeho výskum sa spojil s Hagedornom a vyzval ju, aby premýšľala o svojom potenciáli pre aplikácie, ktoré nie sú cicavcami.
"Povedala: Čo môžete urobiť, aby ste mi pomohli s embryami, " spomína Bischof.
Táto úvodná otázka vyvolala komplexnú a pokračujúcu interdisciplinárnu spoluprácu - takú, v ktorej Hagedorn aj Bischof trvajú na dôležitosti práce druhého.
Ich výsledky, uverejnené tento týždeň v časopise ACS Nano, naznačujú, že je možné koniec koncov bezpečne ohriať zmrazené embryá rýb.
Inšpiráciou pre ich prácu bolo úsilie teraz mŕtveho vedca menom Peter Mazur, ktorý si myslel, že je možné ohriať zmrazené embryá pomocou laserov. (Áno, lasery.) Zatiaľ čo myšlienka bola potenciálne zdravá, je to náročné, povedal mi Hagedorn, aby som nechal lasery prenášať teplo do biologického materiálu. Spoločne s iným výskumníkom menom Fritz Kleinhans však Mazur zistil, že by bolo možné do roztoku zaviesť embryu ďalšiu látku, ktorá by zachytávala teplo z lasera a preniesla ho do biologickej hmoty.
V prípade spoločnosti Mazur to znamenalo sadze vo forme indického atramentu, látky, ktorá dobre absorbuje a prenáša teplo - a látku, ktorá Kleinhans hovorí, si môžete kúpiť jednoducho na Amazon.com. Ak by sa napríklad umiestnil okolo zamrznutého myšacieho embrya, jediný laserový pulz by mohol takmer okamžite priviesť bunkový materiál na izbovú teplotu, čím by obišiel prechodnú fázu otepľovania, pri ktorej hrozí, že sa vytvoria ľadové kryštály. Kleinhans hovorí, že počas skoršej fázy práce Hagedorna dúfala, že táto technika bude fungovať aj pre embryá zebrafish. Bohužiaľ, boli stále príliš veľké a v čase, keď sa vonkajšie teplo dostalo do stredu, už sa tvorili fatálne ľadové kryštály.
Ako však Hagedorn, Bischof a ich spolupracovníci píšu vo svojom novom dokumente, existuje aj iný spôsob. Šírenie indického atramentu na vonkajšej strane embrya nemusí stačiť, ale čo keď do neho pred zmrazením vložili nejaký iný citlivý materiál? Aby sa tak stalo, usadili sa na zlatých nanorodoch - nepatrných molekulárnych štruktúrach, rádoch menších ako ľudské vlasy -, ktoré pred konzerváciou mikroinjektovali spolu s nemrznúcimi látkami do embrya a použili metódy, ktoré Hagedorn pracoval roky predtým.
Ako vedci píšu vo svojom článku, „Tieto nanočastice môžu efektívne generovať teplo, keď sa laserová vlnová dĺžka zhoduje s povrchovou plazmónovou rezonančnou energiou nanočastíc zlata.“ To je zložitý spôsob, ako povedať, že nanorody môžu absorbovať a zosilňovať energiu z krátkeho svetla.
Zlato, rovnako ako mnoho iných látok, vykazuje na nanomateriáli odlišné vlastnosti ako vo veľkom. Dobre kalibrovaný milisekundový laserový impulz môže náhle zahriať embryo prostredníctvom zlata, ktoré sa v ňom distribuuje, a znova ho zohrievať s úžasnou rýchlosťou 1, 4 x 107 ° C za minútu, čo je takmer nepochopiteľná teplota, ktorá sa dá zvládnuť pri rýchlych výbojoch, ktoré výskumníci zamestnávajú.
"V jednom milisekundovom pulze lasera idete z tekutého dusíka na izbovú teplotu, " hovorí Bischof. Je pozoruhodné, že na rozdiel od akejkoľvek metódy, ktorú sa predtým Hagedorn pokúsil, boli výsledky dosť horúce - a dostatočne rozšírené - na úspešné opätovné zahriatie celého embrya zebrafish naraz.
Po prekonaní tejto bariéry ostali otázky. Kľúčom medzi nimi bolo, či by tieto embryá boli stále životaschopné. Ako vedci vo svojej správe uvádzajú, značná časť bola, aj keď nie všetky. Z tých, ktoré rozmrazili, sa 31 percent podarilo len hodinu po zahriatí, 17 percent prekročilo trojhodinovú značku a iba 10 percent sa stále rozvíjalo aj po 24-hodinovej známke.
Aj keď to môže znieť nízko, je to omnoho väčšie ako miera prežitia v nulových percentách, ktorú priniesli predchádzajúce metódy. Hagedorn dúfa, že budúca práca tieto čísla „zvýši“. A ostáva pozitívna okolo 10 percent. „Ryby dokážu produkovať milióny vajíčok, a ak by som mal úspešne zmraziť 10 percent z nich, je to naozaj dobré číslo, “ hovorí.
Pochopenie miliónmi vajíčok by si, samozrejme, vyžadovalo, aby ďalej transformovali proces účinnosti. V tejto chvíli veľká časť tejto práce pripadá na Bischofov a ďalší v jeho laboratóriu, kde sa už pracuje na zlepšení „priepustnosti“ procesu, čo ho potenciálne môže zmeniť na priemyselnejšie úsilie. „Myslím, že v nasledujúcich rokoch bude existovať množstvo podporných technológií, ktoré sa k tomu budú vyvíjať, “ povedal mi.
Ak bude táto práca úspešná, Hagedorn si myslí, že by mohla mať aj iné spôsoby použitia, ktoré siahajú ďaleko za pokornú zebrafish.
"Veľa poľnohospodárov v akvakultúre chce zmraziť ryby [reprodukčný materiál], pretože sa rozmnožujú iba raz ročne, " uviedla. „Máte na rozmach svojich fariem tento rozmach a poprsie. Keby ste mohli embryá z mrazničky vyberať naplánovanejším spôsobom, jedlo by bolo lacnejšie a spoľahlivejšie. “
Môže to mať tiež vplyv na ochranu voľne žijúcich živočíchov. Hagedorn, ktorý dnes pracuje hlavne na koraloch, si myslí, že by to mohlo pomôcť opraviť poškodené útesy. Navrhuje tiež, že by v konečnom dôsledku mohla obnoviť vyčerpanú populáciu žabiek a prípadne zachrániť aj iné druhy. Bez ohľadu na to, kam nás práca v budúcnosti zavedie, je však dôkazom potenciálu vedeckej spolupráce dnes.
„Najskôr to nebolo úprimne cítiť. Dáva to biologickému zmyslu, že sme to dokázali, ale vyzeralo to, že by sme všetky kusy nikdy nedali dohromady, “povedala mi. „Keby som sa na tomto stretnutí nesadol vedľa Johna, nikdy by sme to neurobili. Bez nášho spoločného úsilia - inžinierstva a biológie - by sa to nestalo. “
